DNA片段的连接技术

实验十三 DNA片段的连接技术
一、目的与原理
DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键,这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DNA连接酶和T4DNA连接酶催化,但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作,掌握这一DNA片段的连接技术。
二、材料和方法
1. 仪器
离心机,恒温设备,真空干燥机,取液器
2. 试剂
T4DNA连接酶,10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚,TE缓冲液,电泳缓冲液、3M NaAc
三、操作步骤
取干净、灭菌新Eppendorf管,按下表加入各试液
试液 体积(μl)
T4DNA连接酶缓冲液 1.5
λDNA 10
ATP 1
无菌水 1.5
连接酶 1
总体积 15
19–20℃ 保温2小时,提取已连接好的DNA片段。电泳分析。
四、结果 (略)
五、注意事项
1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃,但该温度下DNA退火效率低,连接效率还不如22℃高。
2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。
实验十四 受体菌感受态细胞的制备
一、目的与原理
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时,即为感受态,而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。
二、材料和方法
1. 材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2. 仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3. 试剂
LB培养基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高钴
TFB:10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步骤
大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)在LB培养基平板上划线培养12-16小时,挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)到对数期。取1ml培养物7000rpm,离心3min,收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体,冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙(或TFB),放置于冰浴,即得感受态细胞,此细胞可现用,也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中,投入液氮,然后储于-70℃保存。
四、结果 (略)
五、注意事项
一般地,新制备的感受态细胞48h后转化效率降低,15d后失效。因此,感受态细胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔,损伤感受态细胞。
实验十五 重组片段的转化及克隆和筛选
一、目的与原理
转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞,使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。
二、材料和方法
1.材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2.仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3.试剂
LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;
TFB:10mM MES(pH 6.3),45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作步骤
1. 感受态细胞融化(在手心)
2. 加入溶于TE的待转化外源DNA,冰浴30min。
3. 42℃热冲击2 min。
4. 冰上2min。
5. 加入0.4 ml LB液体培养基,37℃保温摇床45 min
6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上,37℃培养。
四、实验结果及分析:
培养皿上有白色菌落和兰 色菌落,但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色,所以白色菌落说明转化成功;兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接,若是在原酶切位点的连接进行的转化,菌落为白色;若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化,菌落为兰色(说明在酶切上成功,连接上也成功,转化上也成功)。
五、注意事项
关键要严格控制热激时间,超过2min,则转化会失败。
免疫学实验
实验十六 单向琼脂扩散实验
一、原理
单向琼脂扩散实验又称单向免疫扩散实验。指可溶性抗原在相应抗体的琼脂介质中的扩散,可定性、定量抗原。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.取15ml琼脂糖加到56℃预热玻璃管中,加入约200微升抗血清,充分混匀后铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.待凝胶凝固后打孔,直径为3㎜,将孔内琼脂弄出。
4.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔内,每孔5微升。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果。
三、实验结果
发现沉淀环的大小与抗原的浓度成反比,基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关,而且和琼脂中抗体的浓度有关。
实验十七 双向琼脂扩散实验
一、原理
双向琼脂扩散实验,是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.打孔,孔距为4㎜,
4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。
在周围孔中加入不同浓度的抗体,中心孔加抗原。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果
三、实验结果
浓度不同,形成不同的沉淀的线。
实验十八 免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.在孔内加入抗原,其中一孔内加电泳指示剂。
4.将凝胶板放在电泳槽中进行电泳,确定电泳时间。
5.电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2㎜宽的长槽,加入抗血清。
二、实验结果
将凝胶板放入湿盒,室温放置12小时,可观察在到沉淀弧线。
实验十九 对流免疫电泳
一、操作步骤
1.1%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,凉干。
3.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
4.在孔内分别加入抗原和抗体,每孔5微升,抗体点阳极,抗原点阴极。
5.在电场中电泳50min,5V。
二、实验结果
在小孔中间出现沉淀线。
实验二十 火箭免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台。
3%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.将抗原按倍比稀释,在孔内分别加入标准抗原和代测样品,每孔5微升。
在10V电场中电泳3小时。
二、实验结果
发现在电泳方向上有拖尾,拖尾长度与抗原浓度有关。
 

APSC品牌代理商

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1. APSC品牌介绍
APSC主要提供有机凝胶色谱标准品(Organic GPC/SEC Standards)和水性凝胶色谱标准品(Aqueous GPC/SEC Standards)两类产品。
GPC(Gel Permeation Chromatography),凝胶渗透色谱,又称为尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,简称SEC),它是基于体积排阻的分离机理,通过具有分子筛性质的固定相,用来分离相对分子质量较小的物质,并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子化合物。
GPC是一种特殊的液相色谱,所用仪器与高效液相色谱仪类似,GPC的分离是利用体积排除机理,装填的是多孔性凝胶或微粒,孔径大小与待分离的聚合物分子相似,体积大的高分子化合物不能进入凝胶孔,最先从凝胶粒间流出,淋出体积(时间)最小,高聚物依分子量从大到小依次淋出。这样,通过做已知分子量的高分子聚合物的标准曲线,就能分析同系未知待测高分子化合物了。
2. APSC重点产品
机凝胶色谱标准品(Organic GPC/SEC Standards)和水性凝胶色谱标准品(Aqueous GPC/SEC Standards)两类产品。
3. APSC官网
http://www.ampolymer.com/
4. 金畔生物代理APSC品牌联系方式
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CIL品牌代理商

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1. CIL品牌介绍
美国剑桥同位素CIL是世界上第一个生产稳定性同位素标记化合物的生产商,以其领先的技术雄踞同位素分离领域。主要标记性同位素有13C、12C、D、15N、18O和17O,目前已经拥有8000多种
标记化合物。CIL的产品均能应用于不同的领域,如物理,化学,生物医学,分析,诊断研究以及环境测试。
2. CIL重点产品
稳定性同位素标记化合物
3. CIL官网
http://www.isotope.com/cil/index.cfm
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硫酸葡聚糖 Dextran Sulfate (DSS) - 肠炎模式动物造模试剂

硫酸葡聚糖 Dextran Sulfate (DSS) - 肠炎模式动物造模试剂
溃疡性结肠炎(UC)是一种病因和发病机制尚不十分清楚的慢性肠道炎症性疾病,建立适当的结肠炎动物模型对于研究UC的病因、发病机制以及新的治疗方法具有重要意义。人们制作了多种动物模型对其进行研究,日本学者于1985年首次应用硫酸葡聚糖制备了鼠UC模型,此后,该方法广泛用于筛选治疗炎症性肠病(IBD)的新方法和临床前新药物的开发,也用于研究IBD的发病机制。其具备以下优点:
1.DSS诱导的UC模型的病理改变与人类UC最相似;
2.此模型既可以应用于UC急性期又可应用于慢性期的研究,使实验能够完整地进行;
3.制作简便、经济、易于复制。
参考方法:
方法一:
小鼠给予含50g/L硫酸葡聚糖(葡聚糖硫酸钠)5000或40000的蒸馏水自由饮用7d,出现体重减轻、腹泻、血便等急性肠炎的表现.病理学切片HE染色发现小鼠病变结肠腺体结构紊乱,黏膜和黏膜下单核细胞和多核细胞浸润.DSS组病变肠段组织GSH表达较对照组明显减少(2±0.6 vs 3.14±1.0,t = 3.95, P = 0.01<0.05),病变结肠分泌的IL-4明显升高(38.7±4.7 vs 28.7±6.7,t = 3.16, P = 0.009<0.01),IFN-g轻度降低(P>0.05).
资料来源:《GSH在DSS诱导的小鼠实验性肠炎中的作用》
方法二:
将分子量为50 00或40000的DSS溶于饮用水,配成3% DSS溶液,让BALB/C小鼠自由饮用7d,建立小鼠急性结肠炎模型;②让BALB/C小鼠自由饮用3% DSS溶液7d,然后饮用不含DSS蒸馏水14d,建立小鼠慢性结肠炎模型;模型建立成功的标志为饮用3% DSS 7 d后出现半稀便、腹泻、大便隐血(+)和肉眼血便中的任一症状。
资料来源:《葡聚糖硫酸钠致小鼠结肠炎模型的建立与评价》。
已有研究表明,不同分子量的DSS所诱导的病变特征不同,如用5000, 40,000和500,000的DSS喂养小鼠,结果典型病变只出现于5,000组和40,000组,50,000组的病变主要见于盲肠和上段结肠,此外,DSS结肠炎的严重度并不依赖于DSS摄入量,而是由DSS浓度决定,小鼠饮用的DSS量差别较小时不影响诱导出的结肠炎严重度。再次,不同种属对于不同分子量的DSS的敏感度不一。
相关试剂:
货号 英文名 中文名 分子量 其他
184005 Dextran Sulfate,Na 硫酸葡聚糖 5000 100g
184505 Dextran sulfate,Na 硫酸葡聚糖 36,000~50,000 100g
ACJ0380A Dextran sulphate sodium 硫酸葡聚糖钠 40000 100g、500g
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BioVendor品牌代理商

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1. BioVendor品牌介绍
BioVendor 是欧洲的一家医药科技公司,专注于为分子和细胞学实验室提供体外研究产品,主要产品有重组蛋白、抗体和 ELISA 试剂盒。目前公司致力于有关激素和细胞活素利用方面的研究
,产品相关方向:能量代谢和体重调节、骨代谢、心血管疾病和肾病、感染和发炎、铁代谢研究、肌肉生长控制、神经组织损坏标记、肿瘤学、胰腺调节分子、分泌型磷脂酶 A2等。
2. BioVendor重点产品
重组蛋白、抗体和 ELISA 试剂盒
3. BioVendor官网
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Bio-rad品牌代理商–上海金畔
1. Bio-rad品牌介绍
美国伯乐BIO-RAD公司公司总部设在美国加里福尼亚州的Hercules,在全球有30多家全资子公司,服务于全球超过85,000家科研院所,生物技术和制药公司,和临床实验室。
BIO-RAD公司自1952年成立以来,在50多年中为临床诊断和生命科学研究市场提供了广泛的新型产品和服务,始终居于科学发现的中心地位。 BIO-RAD公司 现今利用多种技术制造并
生产了几千种产品,这些技术包括蛋白质组学、生物信息学、电泳、成像、免疫测定、层析、微生物学和基因转移。根据产品的不同,BIO-RAD公司公司下设三大部门,它们是生命科学部,临
床诊断部和工业材料部,产品种类达6000余种。BIO-RAD公司主要产品有蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品、基因枪与电穿孔仪、定量基因扩增仪、图像分析系统、激光
共聚焦扫描显微镜、酶标仪和洗板机系列、食品检测仪器与试剂、糖化血红蛋白检测系列产品、质控系统、毒物检测产品、血液病毒检测产品等。
2. Bio-rad重点产品
生命科学试剂
临床诊断试剂
3. Bio-rad官网
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1. Cayman品牌介绍
Cayman公司成立于1980年,在过去20多年的发展过程中,始终保持着为全球科研工作者提供高质、优价研究产品的宗旨。该公司目前可以提供 2,138 多种生化和免疫试剂,涉及肿瘤、氧化
氮、神经学、凋亡、氧化性损伤、内分泌学等研究领域。非常有特色的检测试剂盒包括类花生酸类物质、游离的生物标志、环核苷、激素及氧化氮等。此外,还提供多种高质量试剂,如类花
生酸类物质、氧化氮试剂及许多相关脂质、脂肪酸、酶和抗体等。Cayman非常愿意接受各地客户的要求,合成复杂和不稳定分子。
2. Cayman重点产品
生化和免疫试剂
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TRC品牌代理商

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1. TRC品牌介绍
TRC是加拿大全资公司,世界领先的有机化学品(包括碳水化学、芳香化学、氮磷硫化学、放射性同位素及同位素标记物等)制造商,建立于1982年,占地55,000平方英尺,包括研究实验室和
生产车间,主要用于生物学、医学、药学、临床诊断和试验方面的研究和生产。TRC提供生化研究的有机化学品,用于生物技术,制药,诊断。研究特殊化学品。提供从g级到kg级别的定制合
同。
2. TRC重点产品
有机化学品标准品
3. TRC官网
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New England Biolabs(NEB)品牌代理商

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1. New England Biolabs(NEB)品牌介绍
NEB公司——三十多年的卓越品质
NEB公司成立于二十世纪七十年代中期,拥有众多经验丰富的科学家,是生产生命科学试剂的领导者。目前,NEB为基因组研究提供最齐全的重组酶和天然酶,并且公司业务范围已延伸至蛋白质组学和药品开发领域。
回顾三十余年来的历程,NEB公司作为先驱公司之一,为促进生物科技工业的发展做出了巨大的贡献。NEB美国总部乔迁新址后拥有最尖端的设备,有一座现代化的发酵中心及设备齐全的实验室,这些实验室主要用于产品生产、质量监控、产品开发和基础科研之用。作为首批以商业规模生产限制性内切酶的公司之一,NEB一直专注于内切酶的研究,并保持业内领先水平。NEB公司一贯坚持以科学为本的原则,公司生产的试剂因其高质量、高性价比享誉世界。
重组酶
NEB公司对酶的生产与其基础科研不能分开,通过对限制/修饰系统的克隆和过量表达方面的研究,使我们能够大大降低成本,改善产品质量。NEB已经成功克隆了180多种内切酶,其中大多是完全克隆,少数是部分克隆。目前,NEB可供应240多种内切酶,其中180多种可以重组酶形式提供,同时还有大量的应用途广泛的重组聚合酶和重组修饰酶。
质量与客户服务
NEB公司凭借着严格的质检程序、深入的基础科研以及不断开发的研发项目,承诺为全球科技人员提供高纯度的科研产品。直接与NEB总部联系或与NEB的国际网点联系,即可体验到NEB的个性化客户服务。公司内负责生产以及负责进行质量监控的科学家(产品负责人)也就是技术支持人员。他们为客户解答有关限制核酸内切酶、甲基化酶、以及其他DNA修饰酶、蛋白质修饰酶方面的问题。同时,公司的有机合成部门可提供linkers、引物、adaptors、探针以及寡核苷酸合成等方面的信息。研究人员也可为客户提供技术支持服务,这些研究人员在DNA测序、甲基化、克隆、过量表达、发酵、蛋白质纯化以及蛋白质分析方面都有很深造诣。
基础科研
NEB在分子生物学和寄生虫学方面的基础研究由公司内部的资深科学家负责。这些科学家在他们各自的领域都卓有成绩,经常在业内著名杂志上发表文献,指导博士后工作、为大学生提供暑期实习机会,而且经常受邀去当地学校进行演讲。NEB鼓励公司与外界合作,每周学术探讨会为其他科学家们提供了交流和展示的平台。
环保政策
NEB公司在资助科研项目时最基本原则之一就是:一切工作都应符合保护生态环境。公司产品生产、分析以及运输过程既要满足产品的稳定性,也要符合我们的环保政策。20年来,NEB公司最引人注目的一项环保政策是:回收运输泡沫盒,虽然这项工作首创于美国,但是,目前加拿大、德国以及英国的分公司也同样实施了。公司还在内部开展多方位的回收工作,经常用再生纸张印刷市场宣传资料。这些小细节不会影响产品质量,但是对环境的保护却是显而易见。
公司职责
除环保政策外,通过基金会,NEB还竭力为改善当地社区及全人类尽微薄之力。NEB基金会创立于1982年,属私人性质,其宗旨是支持发展中国家的环保、教育、健康及艺术事业。此外,NEB捐款委员会也经常向当地社区进行捐款活动。
NEB公司的国际网络
NEB的国际销售网络是通过其代理商、附属机构和子公司来实现的。所有销售网点都承诺提供高质量、高性价比以及高水准的服务。国际销售网点覆盖的国家有:阿根廷、澳大利亚、奥地利、比利时、巴西、加拿大、中国、丹麦、德国、芬兰、法国、希腊、香港、冰岛、印度、爱尔兰共和国、以色列、意大利、日本、韩国、卢森堡、马来西亚、墨西哥、荷兰、新西兰、挪威、葡萄牙、新加坡、西班牙、瑞典、瑞士、台湾、泰国、英国。没有列出国家的客户可与位于美国的NEB总部取得联系,以便获得更多信息。
2. New England Biolabs(NEB)重点产品
生产和分销研究型抗体
3. New England Biolabs(NEB)官网
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ChromaDex品牌代理商–上海金畔

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1. ChromaDex品牌介绍
Chromadex 公司于1999年在加拿大成立,主要生产植物化学/中草药对照品以及标准材料,是植物参考标准的创造以及植物化学物质的产品和服务的市场领导者, ChromaDex公司提供
多达3000种产品和试剂盒,满足了自然产品的参考标准品、材料、业务的需求。现在是仍然通过严谨的科学以顾客为中心发展参考标准品和业务。
Chromadex是一个生产天然产品的创新性的公司,提供专有的、科学性的溶剂和配料,它们可用于食品强化剂、食品和饮料、化妆品和制药行业。特别是,Chromadex 公司研发和销售植
物化学和植物学的参考标准品和材料。生产和销售新颖的和天然的对人类健康有积极影响的产品。凭着公司的专业的服务和严谨的科学给市场带去安全与高品质。为了满足市场对天然产品的
标准品、材料和服务不断增长的需求,Chromadex 公司在1999年应运而生。随着各种消费类产品的出现,越来越多的消费者和政府机构要求有质量保证的研究方法,
如今Chromadex公司采取以科学严谨性为支撑的消费者为中心的方式,在参考标准品这服务性行业中处于领先地位。它在市面上的专业技术赋予它独特的基础,使它可以结合科学健康的自
然力量去开发和销售天然和新颖的配料。
2. ChromaDex重点产品
植物化学/中草药对照品
3. ChromaDex官网
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Abcam品牌代理商

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1. Abcam品牌介绍
Abcam 位于英国的剑桥科学园,成立于1998年,专门生产和分销研究型抗体。我们的在线目录 (www.abcam.cn) 已有超过120,000 种抗体和试剂,并不断添加,供应予全球百多个国家。Abcam 于2005年11月在伦敦证券交易所上市,在美国、日本、香港、中国均设有分公司。
2. Abcam重点产品
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